Obniżenie aktywności genów naprawy niedopasowań spowalnia wzrost powtórzeń w ludzkich neuronach w chorobie Huntingtona

Naukowcy wykorzystali komórki pochodzące od osoby z chorobą Huntingtona (HD), aby sprawdzić, czy obniżenie poziomu genów naprawy DNA może spowolnić wzrost niebezpiecznego powtórzenia CAG. W tych ludzkich komórkach hodowanych w laboratorium powtórzenie rzeczywiście rosło wolniej, co sugeruje potencjalną strategię terapeutyczną mogącą opóźnić wystąpienie i progresję choroby, choć te prace są wciąż na wczesnym etapie.

Dlaczego ekspandujące powtórzenia CAG mają znaczenie w HD

HD jest spowodowana nieprawidłowo długim odcinkiem trzech liter DNA, CAG, w genie huntingtyny, często skracanym do HTT. Ogólnie rzecz biorąc, rosnąca długość ekspandowanego powtórzenia CAG jest związana z wcześniejszym wystąpieniem objawów HD u ludzi i szybszą progresją choroby.

Wiemy już, że u osób z chorobą Huntingtona długość powtórzeń CAG, którą odziedziczyły, nie jest stała przez całe życie. W niektórych komórkach, zwłaszcza w obszarze mózgu znajdującym się mniej więcej w środku głowy, zwanym prążkowiem, powtórzenia CAG mogą powoli wydłużać się przez wiele lat. Proces ten nazywa się ekspansją somatyczną – ekspansją powtórzeń CAG w komórkach „somatycznych”, czyli komórkach ciała.

Dowody z ludzkiej tkanki mózgowej i zwierząt modelujących HD sugerują, że ten dodatkowy wzrost (ekspansja somatyczna) jest istotnym czynnikiem zwiększającym podatność tych neuronów i głównym czynnikiem napędzającym progresję choroby.

Naprawa DNA: kluczowy czynnik napędzający ekspansję CAG

Nasze DNA jest stale uszkadzane przez takie rzeczy jak promieniowanie UV ze słońca, zanieczyszczenia środowiska i stres wewnątrz naszych komórek. Ale komórki nieustannie pracują nad naprawą tych uszkodzeń w swoim DNA. Jeden z kluczowych systemów odpowiedzialnych za utrzymanie integralności materiału genetycznego nazywa się naprawą niedopasowań (MMR). Działa jak molekularny korektor, lokalizując i poprawiając małe błędy, aby zachować integralność genetyczną.

Jednak wysoce powtarzalna sekwencja CAG w genie HTT jest strukturalnie niestabilna i może tworzyć niezwykłe kształty, takie jak pętle DNA. Kiedy komponenty systemu MMR napotykają te dziwne struktury, proces naprawy prawdopodobnie błędnie odczytuje kod liter DNA, trochę jakby system korektorski akceptował literówki.

Te błędy korektorskie systemu MMR mogą prowadzić do włączenia dodatkowych powtórzeń. W tym kontekście system MMR, który normalnie chroni kod genetyczny, nieumyślnie staje się głównym mechanizmem napędzającym szkodliwą ekspansję powtórzenia CAG.

Ta destrukcyjna rola MMR w przyczynianiu się do HD jest silnie poparta długoletnimi badaniami. Badania genetyczne na dużą skalę, znane jako badania asocjacyjne całego genomu (GWAS), u osób z HD potwierdziły ten związek, identyfikując naturalne różnice genetyczne (warianty) w kilku genach związanych z MMR, które modyfikują wiek, w którym pojawiają się objawy.

Te odkrycia ustanowiły przekonujące strategie terapeutyczne. Jeśli możemy bezpiecznie zmniejszyć aktywność lub poziomy określonych genów MMR, możemy być w stanie skutecznie spowolnić ten proces ekspansji u źródła.

Badanie naprawy niedopasowań w ludzkich neuronach HD

Większość wcześniejszych badań nad naprawą niedopasowań i ekspansją CAG wykorzystywała myszy modelujące HD lub komórki zwierzęce hodowane w naczyniu. W niedawnym badaniu prowadzonym przez dr Sarah Tabrizi z University College London naukowcy wykorzystali system bardziej bezpośrednio związany z ludźmi.

Zaczęli od komórek skóry podarowanych przez siedmioletnią dziewczynkę z młodzieńczą postacią HD, która miała bardzo duże ekspandowane powtórzenie CAG przekraczające 125 w genie HTT. Naukowcy dodali cząsteczki, które skłoniły komórki skóry do przekształcenia się w komórki macierzyste, które są zdolne do samoodnawiania i mogą być kierowane do przekształcenia w różne typy komórek, w tym komórki mózgowe.

Stosując protokoły, które dodają różne substancje chemiczne w różnych momentach, zespół przekształcił komórki macierzyste HD w komórki mózgowe wzbogacone o średnie neurony kolczyste (MSN), które znajdują się w prążkowiu, centralnym regionie mózgu silnie dotkniętym przez HD. MSN to specyficzne komórki mózgowe, o których wiadomo, że są szczególnie podatne na degenerację w HD. Naukowcy konsekwentnie mierzyli długość powtórzenia CAG zarówno w dzielących się komórkach macierzystych, jak i w tych hodowlach komórek mózgowych, aby monitorować, jak długość powtórzenia zmieniała się w czasie.

Wykorzystanie molekularnego ściemniacza

Aby przetestować rolę naprawy niedopasowań, wykorzystali potężne narzędzie genetyczne zwane interferencją CRISPR (CRISPRi). CRISPRi działa jako molekularny system do precyzyjnego zmniejszania aktywności genów w pojedynczych genach na raz. Ten system różni się od standardowej edycji genów, ponieważ nie tnie DNA. Zamiast tego wykorzystuje cząsteczkę, którą można sobie wyobrazić jako molekularne nożyczki, zwaną Cas9, która jest przypięta na poziomie molekularnym do ściemniacza, który skutecznie obniża poziomy docelowego białka.

Zespół wykorzystał CRISPRi do zmniejszenia aktywności genów naprawy niedopasowań, które zostały zidentyfikowane w ludzkich badaniach genetycznych (GWAS). Celowali również w partnerów tych genów MMR. Docelowe geny obejmowały komponenty z rodzin kompleksów wielobiałkowych, rodziny MutS (MSH2, MSH3, MSH6) i rodziny MutL (MLH1, PMS1, PMS2, MLH3), wraz z enzymem, ligazą DNA 1 (LIG1).

Celem badania było zmniejszenie ich aktywności do poziomów możliwych do osiągnięcia przez leki terapeutyczne, a nie całkowite wyeliminowanie genów. To podejście pozwoliło im bardziej realistycznie naśladować to, co mogłoby zostać opracowane jako leczenie, lub imitować te warianty, które okazały się naturalnie występować u osób z HD, które miały późniejsze wystąpienie objawów.

Następnie badacze sprawdzili, czy ich eksperymenty zakończyły się sukcesem, przeprowadzając kolejne doświadczenie zwane „testem niedoboru MMR”. Pozwoliło im to potwierdzić, że faktycznie obniżają aktywność docelowych genów MMR. W tym celu potraktowali komórki substancją chemiczną, która naśladuje uszkodzenia DNA. W komórkach z w pełni funkcjonującym systemem MMR substancja ta zazwyczaj wywołuje śmierć komórki. Ale jeśli funkcja MMR jest osłabiona, komórki są w stanie przetrwać.

Eksperyment potwierdził, że system MMR w zmodyfikowanych komórkach był osłabiony, wykazując zwiększone przeżycie komórek w porównaniu z kontrolami. Co ważne, zmniejszona funkcja nie była całkowita, co jest zgodne z celem częściowej redukcji i daje naukowcom system, w którym mogą molekularnie ściemniać poziomy tych genów, aby je przyciszyć, a nie wyłączyć.

Wpływ ściemniania genów MMR na ekspansje CAG

Na koniec przyjrzeli się tempu, w jakim powtórzenie CAG ekspandowało zarówno w dzielących się komórkach macierzystych, jak i w wyspecjalizowanych neuronach prążkowia, porównując tempo ekspansji z i bez zmniejszonej aktywności genów naprawy niedopasowań.

W komórkach macierzystych HD powtórzenie CAG normalnie rosło z czasem, co było oczekiwane. Ale kiedy kilka genów naprawy niedopasowań zostało przyciszonych za pomocą CRISPRi, ten wzrost zwolnił, co sugeruje, że teoria zespołu była prawidłowa! Najsilniejsze efekty spowalniające zaobserwowano, gdy zespół zmniejszył główne komponenty MutS (MSH2 i MSH3) oraz rdzenną składową MutL (MLH1). Obniżenie tych genów zmniejszyło tempo ekspansji w dzielących się komórkach macierzystych o 60–65%, a inne czynniki MutL (PMS1, PMS2 i MLH3) zmniejszyły tempo o 25–35%.

Co najważniejsze, podobne wzorce zaobserwowano w hodowlach komórek mózgowych wytworzonych z tych samych komórek macierzystych HD. Naukowcy strategicznie skupili się na czynnikach MutL (PMS1, PMS2 i MLH3) w neuronach, ponieważ wcześniejsze eksperymenty na komórkach macierzystych wykluczyły MSH6 i LIG1, a MSH2 stwarzało potencjalne obawy dotyczące bezpieczeństwa ze względu na ryzyko raka. Nie zagłębili się również w MSH3, ponieważ jest aktywnie rozwijany jako cel terapeutyczny gdzie indziej.

W neuronach, przy przyciszonym MLH1, ta ekspansja zwolniła o 69%, a celowanie w PMS1, PMS2 lub MLH3 również spowolniło ekspansję o ponad 20% w porównaniu z komórkami kontrolnymi. To pokazuje, że naprawa niedopasowań pozostaje kluczowym czynnikiem napędzającym ekspansję somatyczną w ludzkich neuronach HD, nie tylko w dzielących się komórkach macierzystych lub u myszy. Dodatkowo pokazuje, że dostosowując poziomy tych konkretnych genów MMR, naukowcy mogą być w stanie znacząco spowolnić ekspansję somatyczną. Bardzo ekscytująca perspektywa!

Co badanie wykazało, a czego nie pokazuje

Mówiąc prościej, główne przesłanie tych badań brzmi: w ludzkich neuronach hodowanych w naczyniu, które zostały stworzone z osoby z HD, przyciszenie genów naprawy niedopasowań wydaje się wystarczające, aby spowolnić wzrost szkodliwego powtórzenia CAG.

Ta praca jest zachęcająca dla idei terapii „przeciwdziałających ekspansji”. Jednocześnie ważne jest, aby jasno określić, czego to badanie nie pokazuje. Wszystkie prace wykonano na komórkach w szalkach, a nie w żywych mózgach. Wykorzystano tylko jedną linię komórek macierzystych HD o wczesnym początku, z bardzo długim powtórzeniem.

Badanie zmierzyło długość powtórzenia CAG i jego rozkład. Nie testowało przeżycia neuronów, zachowania ani funkcji mózgu. Nie zajęło się również długoterminowym bezpieczeństwem. Geny naprawy niedopasowań pomagają chronić wszystkie tkanki przed rakiem, a zmiana ich aktywności u ludzi niesie ryzyko wywołania raka, szczególnie że utrata genów takich jak MSH2 i MLH1 jest związana ze znacznie zwiększonym ryzykiem nowotworów układu nerwowego, przy czym PMS2 również niesie pewne ryzyko.

To, co praca zapewnia, to bardziej realistyczna krótka lista genów naprawy niedopasowań, które wyglądają obiecująco w ludzkim kontekście HD, podkreślając członków rodziny MutL, szczególnie PMS1, jako potencjalne cele. Wspiera ideę, że ostrożne zmniejszenie aktywności wybranych genów naprawy niedopasowań, prawdopodobnie w umiarkowanym stopniu i być może w kombinacji, może być cennym sposobem spowolnienia ekspansji CAG. Te informacje mogą pomóc w kierowaniu projektowaniem i priorytetyzacją przyszłych terapii, które mają na celu nie tylko leczenie objawów, ale zmianę tempa samej choroby Huntingtona.

Podsumowanie

• Naprawa niedopasowań napędza ekspansję CAG w ludzkich neuronach: Wykorzystując komórki mózgowe stworzone z osoby z HD, które były hodowane w naczyniu laboratoryjnym, naukowcy potwierdzili, że system naprawy niedopasowań napędza wzrost powtórzenia CAG w ludzkich neuronach, nie tylko u myszy lub w dzielących się komórkach.
• Przyciszenie genów naprawy spowolniło ekspansję: Częściowo zmniejszając aktywność określonych genów naprawy niedopasowań, zespół spowolnił wzrost powtórzenia CAG nawet o 69% w neuronach, przy czym członkowie rodziny MutL, szczególnie PMS1, wyłonili się jako potencjalne cele terapeutyczne.
• Odkrycia genetyczne mają teraz wsparcie eksperymentalne w ludzkich komórkach: Duże badania genetyczne wcześniej wskazywały na geny naprawy niedopasowań jako modyfikatory wystąpienia HD. To badanie potwierdza ich rolę w ludzkich neuronach hodowanych w naczyniu laboratoryjnym i pomaga priorytetyzować, które geny celować. Praca została wykonana na pojedynczej linii komórkowej w naczyniu, ale jest ważnym krokiem w kierunku terapii, które mają na celu spowolnienie ekspansji CAG.