Blokowanie toksycznego fragmentu: nowe badanie na myszach podkreśla znaczenie HTT1a w chorobie Huntingtona

Nowe badanie, wykorzystujące precyzyjną edycję genów w mysim modelu choroby Huntingtona (CH), dostarcza dowodów na to, że mały fragment białka huntingtyny (HTT), zwany HTT1a, jest centralnym czynnikiem napędzającym CH. Poprzez zmniejszenie poziomu HTT1a, naukowcy opóźnili objawy CH, takie jak zlepianie się białek, przywrócili prawidłowe włączanie i wyłączanie genów oraz unormowali biomarkery u myszy modelujących CH. Odkrycie najbardziej toksycznej formy HTT napędzającej chorobę może mieć ważne implikacje dla projektowania leków obniżających poziom HTT.

Szybkie przypomnienie: powtórzenia CAG i HTT1a

Każda osoba z CH ma zmianę w kodzie genetycznym swojego genu HTT. Powtarzający się ciąg liter DNA C-A-G rozszerza się, tworząc zbyt wiele powtórzeń. Osoby z 40 lub więcej powtórzeniami CAG w genie HTT zachorują, jeśli dożyją odpowiednio długo, a dłuższe powtórzenia są zazwyczaj związane z wcześniejszym początkiem choroby.

Rozszerzone powtórzenie CAG w genie HTT powoduje odpowiadające mu rozszerzenie w kodowanym białku HTT, które jest wytwarzane na podstawie tych instrukcji genetycznych. Jednak powtórzenie CAG nie tylko zmienia sekwencję białka. Wpływa również na sposób przetwarzania pośrednika między DNA a białkiem – informacyjnego RNA.

Kopia genetycznego przepisu

Informacyjny RNA to genetyczna cząsteczka przekaźnikowa. Jest tworzona jako wierna kopia zakodowanej sekwencji DNA dla danego genu, zanim zostanie użyta do wytworzenia białka, które ta sekwencja koduje. Jest to trochę jak zrobienie kopii przepisu z książki, aby móc go ugotować bez konieczności ciągłego wracania do oryginalnej książki.

Gdy powtórzenie CAG jest rozszerzone, może zostać aktywowany ukryty sygnał w informacyjnym RNA HTT. Ten sygnał nazywany jest „krypticznym poliA” i nakazuje maszynerii komórkowej zbyt wczesne zaprzestanie produkcji białka HTT. Oznacza to, że zamiast wytwarzać pełnowymiarowe białko HTT, komórka wytwarza jedynie mały fragment, zwany HTT1a.

HTT1a: toksyczny fragment białka HTT

Fragment białka HTT1a zawiera rozszerzony region, kodowany przez powtórzenie CAG, który wygląda jak wiele powtarzających się aminokwasów glutaminy. Ten fragment jest bardzo podatny na zlepianie się (proces zwany agregacją) i wykazano, że jest toksyczny w wielu zwierzęcych i komórkowych modelach CH.

Co ważne, im dłuższe jest powtórzenie CAG, tym więcej fragmentu białka HTT1a jest wytwarzane. Ponieważ powtórzenie CAG może wydłużać się w niektórych komórkach ciała u osób z CH, proces ten nazywany jest ekspansją somatyczną, uważa się, że HTT1a jest kluczowym etapem w postępie choroby.

Aby lepiej to zrozumieć, naukowcy w tym badaniu zastanawiali się, czy wzrost ilości wytwarzanego HTT1a może być czynnikiem łączącym ekspansję somatyczną z uszkodzeniem komórek nerwowych.

Sprytna strategia genetyczna: usuwanie sygnałów powodujących fragmentację

Aby to bezpośrednio przetestować, zespół wykorzystał mysi model CH, który ma prawie 200 powtórzeń CAG w genie HTT. Jest to znacznie większa liczba powtórzeń niż typowo obserwuje się u ludzi, ale przyspiesza to pojawienie się objawów u myszy, umożliwiając naukowcom szybsze uzyskanie odpowiedzi na ich eksperymenty. Ze względu na specyfikę systemów modelowych CH, myszy te są faktycznie nazywane myszami HdhQ150.

Używając narzędzi CRISPR, które są jak genetyczne nożyczki, usunęli część genu HTT, która zawiera sygnał do tworzenia fragmentu HTT1a. Powinno to zapobiec wytwarzaniu toksycznego fragmentu HTT1a u tych myszy, mimo że liczba CAG jest wystarczająco wysoka, aby wywołać u komórek tworzenie toksycznego fragmentu. Ten nowy typ mysiego modelu CH nazwano myszą HdhQ150ΔI, gdzie Δ (delta) reprezentuje usuniętą domenę genetyczną.

Wykorzystali również myszy z liczbą powtórzeń CAG, które nie powodują CH, aby reprezentować ogólną populację bez CH. U tych myszy również wycięli sygnał tworzący HTT1a, aby mieć kontrolę nad możliwymi efektami edycji genetycznej, niezwiązanymi z liczbą CAG. Oznaczało to, że wiedzieliby, czy obserwowane wyniki były spowodowane samą edycją CRISPR, czy też naprawdę tym, że HTT1a nie był produkowany.

Co stało się z poziomami HTT1a u tych myszy?

Zgodnie z oczekiwaniami, poziomy HTT1a spadły u myszy HdhQ150ΔI. Cząsteczka informacyjnego RNA HTT1a była całkowicie nieobecna u tych myszy, a poziomy białka były obniżone, ale nadal wykrywalne.

Dlaczego jednak nadal znajdowano pewne ilości HTT1a? Naukowcy sugerują, że to usunięcie mogło doprowadzić do odmiennego „odczytywania” genu przez maszynerię genetyczną, w sposób, który nadal produkuje białko HTT1a, ale w bardzo małych ilościach.

Co ważne, poziomy pełnowymiarowego HTT, zarówno nierozszerzonego (normalnego), jak i rozszerzonego (formy CH), pozostały niezmienione. Jest to istotne dla dalszych eksperymentów, aby zespół mógł ustalić, jakie efekty były specyficznie spowodowane redukcją HTT1a, a nie całkowitymi poziomami HTT.

Znaczące opóźnienie w agregacji

Uderzającym wynikiem tego badania było to, że toksyczne skupiska HTT, czyli agregaty, znajdowano w mózgu myszy HdhQ150ΔI znacznie później w porównaniu do myszy HdhQ150.

U standardowych myszy HdhQ150 modelujących CH, agregaty zauważono w różnych regionach mózgu u myszy w wieku 6 miesięcy i ich liczba nadal rosła wraz z wiekiem myszy. Możesz pomyśleć: „Ojej! 6 miesięcy to naprawdę młody wiek!” I miałbyś rację. Szybki przebieg cech choroby CH u tych myszy jest spowodowany bardzo wysoką liczbą powtórzeń CAG i jest celowy, aby wyniki można było uzyskać szybciej.

Jednak u myszy HdhQ150ΔI, które nie wytwarzały toksycznego fragmentu HTT1a, te skupiska były opóźnione o kilka miesięcy, a w niektórych częściach mózgu nie były widoczne, dopóki myszy nie były znacznie starsze. Skupiska te nadal zawierały HTT1a, co wzmacnia ideę, że ten fragment HTT jest ważny dla zapoczątkowania tworzenia tych skupisk.

Wpływ na ekspresję genów

Następnie naukowcy przyjrzeli się, które geny były włączane i wyłączane w tych różnych modelach mysich. Jest to dobrze udokumentowana zmiana, która zachodzi wcześnie w różnych modelach CH, z charakterystycznym wzorcem zmian w przełącznikach genów.

U myszy HdhQ150 z CH, naukowcy odkryli, że ponad 1200 przełączników genów było zmienionych w wieku 6 miesięcy w prążkowiu, głębokim regionie mózgu najbardziej dotkniętym w CH. W wieku 12 miesięcy liczba ta osiągnęła ponad 2800 genów.

U myszy z mniejszą ilością HTT1a, niektóre z tych przełączników genów zostały przywrócone, z poprawą o 25% w wieku 6 miesięcy i o 40% w wieku 12 miesięcy. Kiedy przyjrzeli się innej części mózgu, zwanej hipokampem, tam również zaobserwowali częściową poprawę.

Co ciekawe, nawet niskie, resztkowe poziomy HTT1a u myszy HdhQ150ΔI były wystarczające, aby zacząć naprawiać tę cechę charakterystyczną CH.

Biomarkery: uderzający efekt

Być może najbardziej ekscytujący wynik w tym badaniu pochodził z poziomów biomarkerów, które naukowcy badali w osoczu i płynie rdzeniowym, który opływa mózg, zwanym również płynem mózgowo-rdzeniowym (PMR). Zespół zmierzył NfL, ogólny biomarker zdrowia mózgu, a także BRP39, mysi odpowiednik ludzkiego biomarkera YKL-40, który koreluje ze stanem zapalnym.

U myszy HdhQ150 z CH, oba biomarkery były podwyższone w PMR w wieku 12 miesięcy, co wskazuje, że układ nerwowy tych myszy był chory. Jednak u myszy HdhQ150ΔI, poziomy NfL i BRP39 pozostały na poziomie normalnych myszy bez CH w wieku 12 i 17 miesięcy w PMR, a także były obniżone w osoczu.

Co ciekawe, ten powrót do normalnych poziomów biomarkerów PMR nastąpił, mimo że zmiany w sygnaturze przełączników genów zostały jedynie częściowo przywrócone. Ponieważ NfL i YKL-40 mogą być wykorzystywane w ludzkich badaniach klinicznych do oceny zdrowia mózgu, to odkrycie sugeruje, że redukcja HTT1a może znacząco zmienić biologię CH.

Łączenie kropek od ekspansji somatycznej → HTT1a → agregacja

Ekspansja somatyczna CAG jest obecnie postrzegana przez wielu badaczy CH jako czynnik napędzający CH. W miarę jak powtórzenia CAG rozszerzają się w neuronach najbardziej dotkniętych w CH, poziomy HTT1a będą rosły. Naukowcy w tym badaniu proponują model, w którym:

1. Ekspansja somatyczna zwiększa powtórzenia CAG i produkcję HTT1a.
2. Zwiększone HTT1a prowadzi do większej liczby toksycznych skupisk w tych komórkach.
3. Skupiska te napędzają więcej zmian w przełącznikach genów.
4. To z kolei powoduje chorobę komórek, prowadząc do zmian w poziomach biomarkerów.

Proponują, że ten proces można by spowolnić lub zatrzymać poprzez zmniejszenie poziomów HTT1a, aby przerwać ten proces.

Co to oznacza dla terapii?

Kilka podejść do obniżania poziomu HTT jest w fazie rozwoju lub badań klinicznych. Wiele z nich obniża tylko pełnowymiarową formę HTT. Należą do nich antysensowny oligonukleotyd (ASO) tominersen firmy Roche oraz modulatory splicingu małych cząsteczek, takie jak votoplam i SKY-0515 odpowiednio firm Novartis i SkyHawk.

Inne celują w ekson 1, więc mogą zmniejszyć poziomy zarówno pełnowymiarowego HTT, jak i HTT1a, w tym terapia genowa AMT-130 firmy uniQure i siRNA ALN-HTT02 firmy Alnylam Pharmaceuticals.

To badanie sugeruje, że obniżanie tylko pełnowymiarowej formy HTT może nie być tak korzystne i że redukcja HTT1a może być również ważna. Ponieważ normalne białko HTT pełni ważne funkcje w komórkach, strategie, które specyficznie celują w HTT1a, mogą być bezpieczniejszym i bardziej efektywnym podejściem.

Ważne zastrzeżenia

Mimo to, należy zwrócić uwagę na pewne ważne ograniczenia tego badania. Wszystkie te dane pochodzą od myszy modelujących CH, które mają bardzo długie powtórzenia CAG (~195). Myszy są doskonałym modelem dla naukowców do badania tego typu pomysłów, ale nie żyją tak długo jak ludzie, a większość osób z CH ma średnio około 42 powtórzeń CAG, znacznie mniej niż w tym systemie modelowym.

Mimo to, dane z tego badania z pewnością będą źródłem nowych pomysłów dla innych zespołów do dalszych badań. Bądź na bieżąco z HDBuzz, aby dowiedzieć się więcej o badaniach w tej dziedzinie.

Podsumowanie

• Naukowcy stworzyli mysi model CH, który nie wytwarzał tak dużo fragmentu HTT1a, uważanego za toksyczny w CH.
• Poprzez zmniejszenie poziomów wiadomości HTT1a, naukowcy zaobserwowali opóźnienia w tworzeniu toksycznych skupisk białkowych wytwarzanych przez HTT1a.
• W tych specjalnych myszach z niedoborem HTT1a, geny, które były włączane lub wyłączane, bardziej przypominały myszy bez genu CH, a wiele kluczowych biomarkerów wróciło do poziomów bliższych normie.
• Te odkrycia dostarczają dowodów na to, że HTT1a nie jest tylko produktem ubocznym ekspansji CH, ale czynnikiem napędzającym biologię CH.